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紫外分光光度計(jì)法測(cè)定不同產(chǎn)地瓜馥木中黃酮含量

黃酮類化合物是瓜馥木中主要活性成分之一 ,筆者通過(guò)建立不同產(chǎn)地瓜馥木中總黃酮的紫外分光光度計(jì)測(cè)定方法,以期為瓜馥木藥材的質(zhì)量控制 ,中藥瓜馥木的用藥安全性控制提供依據(jù)。
1  材料與方法

1.1  材料

1.1.1 研究對(duì)象。瓜馥木 , 2005年采自廣西臨桂 ,由廣西師范大學(xué)生命科學(xué)院唐紹清教授鑒定為瓜馥木 [ Fisistigm aoldhami(Hemsl.)Mer.]。

1.1.2 主要試劑。蘆丁對(duì)照品(批號(hào):080 -9303),中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;其他試劑均為市售分析純。 1.1.3 主要設(shè)備：UV1901PC紫外可見分光光度計(jì)、超聲波清洗機(jī)、 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;電子天平,。

1.2  方法

1.2.1 對(duì)照品溶液制備。精密稱取蘆丁對(duì)照品適量(約 10 mg),置于 25.0 ml容量瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)為 70%的乙醇超聲溶解并稀釋至刻度,搖勻 ,即得對(duì)照品溶液。
1.2.2 供試品溶液的制備。精密稱取瓜馥木藥材約 1.0 g, 置于 250.0 ml圓底燒瓶中,加入 100.0 ml體積分?jǐn)?shù)為 70%
乙醇,加熱回流 2 h,放冷 ,補(bǔ)重 ,過(guò)濾 ,精密吸取濾液 3.0 ml, 蒸干,殘?jiān)蛹s 2.0 ml水溶解,通過(guò)聚酰胺色譜柱, 依次用水、50%乙醇、90%乙醇洗脫至無(wú)色 ,合并 50%乙醇和 90%乙醇洗脫液,蒸干,備用。

1.2.3  顯色條件的考察。

1.2.3.1 加熱時(shí)間的考察 。精密吸取藥材溶液 5份,每份 2.0 ml,置于加有鎂粉 250 mg的具塞刻度試管中,置于冷水浴中,逐漸滴加濃 HCl3.0 ml,并不時(shí)振搖試管,后加入70%乙醇至 7.0 ml,搖勻 ,置于沸水浴中分別加熱 20、40、60、80、100 min,取出,迅速冷卻至室溫后再加入 70%乙醇補(bǔ)足至 7.0 ml,搖勻,依次測(cè)定吸光度。

1.2.3.2 鎂粉用量的考察。精密吸取藥材溶液 5份,每份 2.0 ml,分別置于加有不同量鎂粉的具塞刻度試管中,置于冷水浴中,逐漸滴加濃 HCl3.0 ml,并不時(shí)振搖試管;后加 70%乙醇至 7.0 ml,搖勻,置沸水浴中加熱 1 h,取出,迅速冷卻至室溫后再加入 70%乙醇補(bǔ)足 7.0 ml,搖勻,依次測(cè)定吸光度值。

1.2.4.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定。分別精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液 1.0 ml和供試品溶液 2.0 ml,置于加有 250 mg鎂粉的具塞刻度試管中,置于冷水浴中,逐漸滴加濃 HCl3.0 ml,并不斷振搖試管,后滴加入 70%乙醇至 7.0 ml,振搖均勻,放置沸水浴中加熱 1 h,迅速冷卻至室溫后再加入 70%乙醇補(bǔ)足至 7.0 ml,搖勻,在 400 ～ 800 nm范圍內(nèi)測(cè)定紫外吸收光譜,確定測(cè)定波長(zhǎng)。 1.2.4.2 線性關(guān)系考察。精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 ml,分別置于加有鎂粉 250 mg的

具塞刻度試管中,置于冷水浴中,逐漸滴加濃 HCl3.0 ml,并不時(shí)振搖試管,后加 70%乙醇補(bǔ)足至 7.0 ml,搖勻,置沸水浴中加熱 1 h,取出 ,迅速冷卻至室溫后再加入 70%乙醇補(bǔ)足至 7.0 ml,搖勻,于測(cè)定波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以蘆丁對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo),吸光度 (Y)為縱坐標(biāo),計(jì)算回歸方程。 1.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 。精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液 1.0 ml和供試品溶液 2.0 ml,顯色后 ,分別在第 0、15、30、45、60 min測(cè)定吸光度值。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值(RSD)。

1.2.4.4 精密度試驗(yàn)。精密吸取供試品溶液 3.0 ml,置于加有鎂粉 250 mg的具塞刻度試管中,按 “1.2.4.1”中方法測(cè)定吸光度值 ,連續(xù)測(cè)定 6次,計(jì)算 RSD值。

1.2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 。精密稱取同一批瓜馥木藥材 6份,每份約 25 mg,分別置于 50.0 ml容量瓶中 ,加入 70%乙醇超聲溶解,定容至刻度,搖勻 ,備用。精密吸取 3.0 ml溶液 ,按“1.2.4.1”中方法測(cè)定吸光度值,計(jì)算 RSD值。

1.2.4.6 加樣回收率試驗(yàn)。取同一批瓜馥木藥材 6份,每份約 5 mg,分別置于 10.0 ml容量瓶中,按照“1.2.2”中方法制備樣品溶液,分別精密加入濃度為 0.434 8 mg/ml的蘆丁對(duì)照品溶液 0.1 ml,再加入 70%乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻。精密吸取 2.0 ml樣品測(cè)定,計(jì)算平均回收率及 RSD值。

1.2.5 不同產(chǎn)地瓜馥木黃酮含量測(cè)定。精密稱取 3批瓜馥木藥材粉末各約 1.0 g,分別置于 250.0 ml圓底燒瓶中,按“1.2.2”中方法制成供試品溶液 ,按“1.2.4.1”中方法測(cè)定吸光度值,計(jì)算黃酮含量。

2  結(jié)果與分析

2.1  顯色條件考察結(jié)果

2.1.1 加熱時(shí)間的考察 。加熱時(shí)間對(duì)吸光度值的影響可知 ,加熱 60 min時(shí)吸光度大,故顯色時(shí)間選擇 60 min。

2.1.2 鎂粉用量的考察。結(jié)果表明,鎂粉用量為 250 mg時(shí)吸光度大,故鎂粉用量選擇 250 mg。
2.2  方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定 。蘆丁對(duì)照品和待測(cè)樣品顯色前后的吸收紫外光譜可知,對(duì)照品和樣品均在 516 nm處有大吸收,故確定 516 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2.2 線性關(guān)系考察結(jié)果。計(jì)算得回歸方程為 Y=7.490 9X -0.025 6(r=0.9991),表明在0.0056 ～ 0.1120mg/ml范圍2.2.3 穩(wěn)定性。蘆丁對(duì)照品和藥材溶液顯色后 60 min內(nèi)基本穩(wěn)定,計(jì)算得 RSD值為 1.12%和 1.28%(n=5)。

2.2.4 精密度。計(jì)算得 RSD值為 0.45%,表明試驗(yàn)精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性。計(jì)算 RSD值為 0.28%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6  回收率。回收率測(cè)得結(jié)果見表 1。由表 1可知,平均回收率為 99.76%, RSD值為 2.85%。

2.3  不同產(chǎn)地瓜馥木黃酮含量測(cè)定結(jié)果 不同產(chǎn)地瓜馥木黃酮含量測(cè)定見表 2。由表 2可知,產(chǎn)地 7 的瓜馥木中黃酮含量高,為 0.833%。

3  結(jié)論與討論

(1)在考察顯色方法的過(guò)程中,筆者曾采用 NaNO2-Al(NO3 )3-NaOH比色法 ,但該方法樣品大吸收波長(zhǎng)與對(duì)照品大吸收波長(zhǎng)相差較大,而且用該反應(yīng)測(cè)定黃酮類化合物專屬性較差 ,終采用鹽酸鎂粉比色法作為瓜馥木總黃酮含量測(cè)定方法。

(2)考察顯色條件時(shí),由于藥材中雜質(zhì)較多,成分比較復(fù)雜 ,該研究對(duì)藥材提取物,采用聚酰胺樹脂進(jìn)行了初步的純化,以便獲得較好的峰形。

(3)采用紫外分光光度法測(cè)定了 9個(gè)不同產(chǎn)地瓜馥木中
總黃酮的含量,除了 6、8和 9 號(hào) 3個(gè)產(chǎn)地的含量略微低于0.8%,其他產(chǎn)地的總黃酮含量基本穩(wěn)定。測(cè)定結(jié)果的 RSD值均符合要求,說(shuō)明該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可行。