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1 試驗方法分析

1.1 試驗原理 雙乙酰測定的原理是采用水蒸氣蒸餾, 使雙乙酰作為揮 發(fā)性組份從啤酒樣中蒸發(fā)出來, 然后加入試劑鄰苯二胺, 反應(yīng) 生成 2 ,3 - 二甲基喹喔啉。在波長 335nm 處有一吸收峰, 可作 定量測定。由于鄰苯二胺和 2 ,3 - 戊二酮等均有此反應(yīng), 因 此, 本法測得的為聯(lián)二酮的總量(以雙乙酰表示)。另外, 如樣品 中含有雙乙酰甲基甲醇, 也會在蒸餾過程中分解生成雙乙酰, 使測定結(jié)果偏高[2] 。

1.2 試驗儀器 1.2.1 帶有加熱套管的雙乙酰蒸餾器; 

1.2.2 具有錐形瓶(或平底蒸餾燒瓶)的蒸汽發(fā)生瓶: 2000mL(或 3000mL); 

1.2.3 容量瓶: 棕色 25mL( 避光) ;

1.2.4 紫外分光光度計: 備有 10mm、20mm、30mm 的石英比色 皿或玻璃比色皿。

1.3 試劑和溶液 1.3.1( 4mol/L) 鹽酸溶液: 按 GB/T 601 配制;1.3.2( l0g/L) 鄰苯二胺溶液: 稱取鄰苯二胺 0.100g, 溶于 4mol/L 鹽酸溶液中, 并定容 至 10mL, 搖勻, 放于暗處。此溶液須當天配制與使用; 若配制 出來的溶液呈紅色, 應(yīng)重新更換新試劑;

1.3.3 有機硅消泡劑(或甘油聚醚)。

1.4 試驗步驟

1.4.1 蒸餾 將雙乙酰蒸餾器安裝好, 加熱蒸汽發(fā)生瓶, 使水至沸。通 汽預(yù)熱后, 置 25mL 容量瓶于冷凝器出口接受餾出液, 外加冰 浴冷卻; 加 3 滴消泡劑于 100mL 量筒中, 再注入未經(jīng)除氣的 預(yù)先冷至 5℃左右的酒樣 100mL, 迅速移入已預(yù)熱的蒸餾器 內(nèi), 并用少量水沖洗量筒及帶塞漏斗, 蓋塞。然后用水封口, 進 行蒸餾, 直至餾出液接近 25mL(蒸餾需在 3～5min 內(nèi)完成)時 取下容量瓶, 達到室溫用水定容, 搖勻。

1.4.2 顯色與測量 分別吸取餾出液 10.0mL 于兩支干燥的比色管中, 并于第 一支管中加入鄰苯二胺溶液 0.5mL, 第二支管中不加 (做空 白), 充分搖勻后, 同時置于暗處放置 20～30min, 然后于 支管中加 4mol/L 鹽酸溶液 2mL, 于第二支管中加入 4mol/L 鹽 酸溶液 2.5mL, 混勻后, 于 335nm 波長下, 用 20mm 石英比色 皿, 以空白調(diào)儀器零點, 測定其吸光度。( 比色測定操作須在 20min 內(nèi)完成, 有條件的此過程好在暗室中進行)

1.5 計算結(jié)果 試樣中雙乙酰含量按下式計算:式中: X - 試樣中雙乙酰的含量, mg/L; A335 - 試樣在 335nm 波長下, 用 20mm 比色皿測得的吸 光度; 1.2- 使用 20mm 石英比色皿時, 吸光度與雙乙酰含量的 換算系數(shù)。 

2 測定結(jié)果與討論

2.1 方法精密度的考察 通過對啤酒樣品的多次測定( n=6) , 按照公式( 2) 、( 3) 計 算方法的相對偏差和變異系數(shù), 考察方法的精密度, 并將方法 改進前后兩組測定結(jié)果列于表 1、表 2。

2.2 討論 2.2.1 測定誤差 眾 所 周 知 , 分 光 光 度 計 比 較 適 宜 的 吸 光 度 范 圍 是 A = 0.2~0.8。但在此法測定雙乙酰含量時, 吸光度的值是很小 的, 所以這是造成測定誤差較大的主要原因。因為在正常的工 作環(huán)境下, 對于一個給定的分光光度計來說, 透光率讀數(shù)誤差 △T 是一個常數(shù), 約為 0.01~0.02。而透光率 T 與吸光度 A 之 間是對數(shù)關(guān)系, 同樣大小的△T, 在不同的 A 值時所引起的吸 光度的誤差△A 是不相同的。由以下推導(dǎo)可以看出, A 值愈 大, △T 引起的△A 愈大。( 以下△T、△A、△X 均為偏差) A = log 1/T = - log T

(4) 由于 A = KX(比耳定律)

(5) △A = K △X

(6) 所以△A/ A = △X/ X

(7) 因此, 當 X 很低時, A 值很小, 這時△T 引起的△A 和△X 也很小, 但因為此時 X 很小, 所以相對偏差△X/ X 是比較大 的。 設(shè)雙乙酰含量為國標(優(yōu)級)的上限 0.13mg/ L , 按式(1)計 算, 相應(yīng)的吸光度 A = 0.13/1.2 = 0.108 由 A = - log T 得出 T = 0.78 若△T = 0.01 則△A = 0.006 相對偏差△X/ X = △A/A = 0.006/ 0.108 = 5.4 % 事實上, 大多數(shù)企業(yè)為控制成品啤酒雙乙酰的回升現(xiàn)象, 雙乙酰內(nèi)控指標是很低的, 一般控制在 0.05mg/ L 左右, 這時, 相應(yīng)的吸光度 A = 0.042 若△T = 0.01 則△A = 0.005 相對偏差△X/ X = △A/A = 0.005/ 0.042 = 11.9 % 由此可見, 雙乙酰測定結(jié)果的精密度較差, 可靠程度較 小, 這樣勢必會造成同一樣品平行測定結(jié)果的重現(xiàn)性差, 不同 實驗室的測定結(jié)果就更難比較了。

2.2.2 其他因素對測定結(jié)果的影響 雙乙酰測定結(jié)果往往比實際偏高, 這主要是由于在酵母 形成雙乙酰的過程中, 生成一種叫 α- 乙酰乳酸的物質(zhì), 這種 物質(zhì)極不穩(wěn)定能較快地被氧化成為雙乙酰, 也更易干擾雙乙 酰的測定, 在啤酒發(fā)酵中似乎未檢出這種物質(zhì), 它也可能是造 成雙乙酰測定偏差的主要原因[3,4] 。

2.2.2.1 取樣 取樣前酒樣釋放的量要適量, 取樣要準確, 在取樣的同 時, 樣品內(nèi)存在酵母和空氣以及溫度上升和時間的延長, 都可 能直接引起雙乙酰迅速變化, 所以, 我們用紫外分光光度計法 測定酒樣或半成品酒樣在取樣的時候, 要盡量多放一些酒樣, 把瓶頸口或管道中酵母雜質(zhì)沖下去, 這樣取來的酒樣才能較 為均勻, 有代表性, 雙乙酰測定的數(shù)值才能準確[5] 。

2.2.2.2 消泡劑 根據(jù)實際測量, 加不加消泡劑對測定值影響很大。若加入 消泡劑, 則所測雙乙酰值會明顯增大, 這可能是消泡劑同時有 促進雙乙酰前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為雙乙酰的作用。

2.2.2.3 蒸餾 在倒入酒樣進行蒸餾的時候, 蒸餾要迅速, 要在 3min 內(nèi) 蒸完。同一樣品隨蒸餾時間的延長, 其測定結(jié)果隨之升高。這 主要與樣品中存在聯(lián)二酮類的前驅(qū)物質(zhì)有關(guān)。在實際操作中 常由于電爐功率大小、冷卻效果的好壞存在差異, 使實際蒸餾 時間發(fā)生波動。當高溫時, α- 乙酰乳酸的非酶氧化速度很快, 時間不同, 它的轉(zhuǎn)化率也不相同, 造成了前驅(qū)物質(zhì)存在數(shù) 量不等的轉(zhuǎn)化, 這在半成品的測定時尤為突出[6] 。 而且, 酒樣在存放中時間過長、蒸發(fā)器溫度過高, 也會引 起雙乙酰揮發(fā)。蒸餾時有間隔, 使空氣進入蒸餾器中, 酒樣接 觸空氣中的氧, 也影響測定數(shù)據(jù)的準確性。

2.2.2.4 顯色劑 顯色劑鄰苯二胺是顯色反應(yīng)的關(guān)鍵, 此藥一定要在暗處 保存, 且不能超期存放, 否則, 試劑的顏色會變得發(fā)黃、發(fā)黑, 配制出的標準試劑會帶有顏色, 使測定結(jié)果偏高。所以配制此 藥時一定要精心, 且當天配制, 當天使用。顯色劑鄰苯二胺加 量以 0.5mL 為宜, 暗處反應(yīng)時間可控制在 15～25min。

2.2.2.5 顯色溫度 顯色反應(yīng)速度與溫度有關(guān)。實驗表明, 隨著顯色溫度升 高, 反應(yīng)速度加快, 其顏色逐步加深, 吸光度增加, 會使測定 結(jié)果偏高; 溫度過低, 反應(yīng)不充分, 則會使測定結(jié)果偏低。這可 能同參與顯色的物質(zhì)成份有關(guān)。由于不同的環(huán)境、不同的季節(jié) 溫度懸殊較大, 所以測定結(jié)果會有誤差。但國標中未對測定時 的顯色溫度作出規(guī)定。

2.2.2.6 比色皿 雙乙酰的測定選用波長為 335nm, 屬紫敏光源, 按儀器使 用說明書, 在此波長下進行比色一定要使用石英比色皿, 若使 用玻比色皿會使測定結(jié)果偏高。國標中未對比色皿的材質(zhì)做 出明確規(guī)定, 一些化驗室使用玻璃比色皿也可能造成一定的 誤差。

3 提高測定結(jié)果準確度的建議 , 為使測定結(jié)果得到較高的準確度, 應(yīng)經(jīng)常校正分光 光度計的靈敏度和波長精度, 并盡量控制被測溶液的吸光度 接近于 0.2~0.8 的范圍。為此, 建議測定時使用 30mm 的石英 比色皿。( 這時的雙乙酰含量按下式計算: X=A335×0.8。) 第二, 為了滿足反應(yīng)要求, 要盡可能的選擇理想的測定方 法, 取樣要準確。取樣前酒樣釋放的容量要適量, 酒樣存放的 時間要短, 蒸餾要迅速, 并控制蒸餾時間在 3min 之內(nèi), 酒樣接 觸空氣中氧的時間要盡量縮短, 得到 25mL 餾出液即可, 否則 測定結(jié)果偏高。 第三, 根據(jù)試驗結(jié)果, 蒸餾啤酒中雙乙酰時收集溫度以在 室溫以下直接收集為宜。加不加消泡劑對測定值影響很大, 若 加入消泡劑, 則所測雙乙酰值會明顯增大。 第四, 嚴格按要求配制顯色劑等標準溶液。鑒于顯色溫度 對測定結(jié)果會產(chǎn)生一定的影響, 建議將顯色溫度統(tǒng)一規(guī)定為 20℃(或 25℃)。顯色劑鄰苯二胺加量以 0.5mL 為宜, 暗處反應(yīng) 時間可控制在 15～25min。 后, 儀器使用要正確, 操作要準確熟練。盡量減少各種 操作誤差, 保證雙乙酰測定的準確度 。